理解神經系統，不只是研究細胞本身，更是解碼生物學中最復雜的系統之一。神經元形成動態網絡，通過電信號與化學信號持續交流，并與星形膠質細胞、小膠質細胞及周圍微環境相互作用。在實驗室中重現這種復雜性極具挑戰，但對研究神經發育、功能與疾病機制至關重要[1]。

這正是體外模型的價值所在。它能在保留關鍵生物學行為的前提下，適度簡化復雜體系，便于研究者解析特定分子與細胞機制。歷經發展，體外模型已從簡單的平面培養，演進為高精度3D培養系統、類器官與可控微環境體系[2]，不同模型從不同維度揭示神經系統的運行規律。

二維神經元培養通常是神經科學研究的起點，這得益于其獨特優勢：它提供干凈、可控的環境，可高精度觀察單個細胞及其行為。在2D體系中，神經元在平面基質上生長，便于追蹤神經突生長、極性建立與突觸形成，同時具備極佳的光學可達性，適用于高分辨率熒光成像、鈣成像與活細胞分析[3]。

這種簡潔性讓研究者可聚焦特定細胞機制，并實現高度定量分析。如今，二維神經元培養已成為自動化成像工作流程的核心，通過高內涵成像和基于人工智能的分析對數以千計的細胞進行分析[4]。經過成像優化的耗材，如(μ-Plate 96 well)96孔培養板和(μ-Plate 384 well)384孔培養板板，以穩定培養條件與可靠光學質量支持這些方法，使檢測細微的表型變化更加容易。

然而，2D培養的神經元仍然缺乏天然組織中的空間背景和機械刺激，這可能影響網絡形成、連接和對刺激的響應方式。盡管如此，2D培養仍然是重要的基礎，尤其是在精度和可重復性至關重要時。

從2D到3D的轉變，不僅僅是幾何形狀的改變，更是神經元行為的深刻革新。與在平面上鋪展不同，細胞開始在周圍的基質中導航，自主決定生長的位置、連接的方式以及網絡的穩定。這種三維環境引入了空間約束、局部梯度和機械阻力，所有這些都影響著神經元網絡的形成和隨時間的演化。

這創造了一個更接近生理的微環境，細胞不僅彼此相互作用，還與周圍基質相互作用，從而形成更復雜的網絡、改善分化并獲得更具生理學相關性的行為。神經球狀體（Neural spheroids）是常見的例子，細胞自組織成致密、相互連接的結構，模仿了組織組織的某些方面。

在3D培養系統中，腦類器官代表了更高層次的生物學復雜性。這些系統源自多能干細胞，包括誘導多能干細胞，它們能自組織成類組織結構，具有多重神經細胞類型和區域特異性身份。這些系統使研究者能夠在體外重現人類大腦發育和功能的關鍵方面，從早期模式化到網絡形成，并用于研究神經發育障礙、神經退行性疾病以及影響大腦的病毒感染[5,6]。

圖2.小鼠神經干細胞經視黃酸誘導分化后，在多聚-L-賴氨酸包被玻璃上形成的神經球。神經元用Tuj1染色，星形膠質細胞用GFAP染色，細胞核用DAPI染色。圖片提供：Lina Papadimitriou, Anthi Ranella, TERMIM Lab, Institute of Electronic Structure and Laser, Crete, Greece

現代3D系統的強大之處在于，能夠將結構復雜性與受控環境相結合。標準化的耗材，如：

? μ-Plate 96 Well 3D(96孔3D培養板)：支持高通量環境中實現可重復的凝膠基質實驗

? μ-Slide 15 Well 3D(15孔3D培養載玻片）：支持受控的基質包埋，試劑消耗量低

一個極具吸引力的問題是：細胞團何時從單純模型轉變為具備網絡功能的系統？

腦類器官并不具備意識層面的“思考”，但能實現令人矚目的功能活動：產生自發電活動、形成同步放電節律、構建功能性神經網絡。它們并非在思考，而是開始彼此“對話”。

這些早期相互作用，為解析大腦自我構建過程提供獨特視角。研究者可實時觀察信號如何產生、連接如何穩定、網絡行為如何演化，這使得類器官成為活體測試系統，我們可以在其中實時研究功能形成的初步階段。

同時，類器官也帶來了挑戰。缺乏血管化限制了營養供應和生長，而樣本間的變異性可能影響可重復性。因此，謹慎的操作和穩定的培養條件對于獲得一致可靠的結果至關重要。

構建結構只是研究的一部分。要真正理解神經元行為，必須精準調控周圍微環境。細胞對流體剪切力、濃度梯度、空間排布等物理與化學信號高度敏感，這些信號決定網絡的形成與功能。

在神經系統中，內皮細胞持續處于流體環境中，剪切應力影響細胞形態、信號傳導與屏障完整性。體外可控流體體系，可用于研究血腦屏障功能與功能異常機制。

微流控系統可精準調控流體、梯度與營養交換，為原本靜態的培養增加動態條件，從而提高生理學相關性[7]。例如：

? μ-Slide I Luer 3D （單通道3D培養載玻片）

? μ-Slide Spheroid Perfusion （球體灌注通道培養載玻片）

等上述平臺可將3D培養與受控流動相結合，用于可重復的實驗。

圖3.微流控系統中的受控流動引入了剪切應力和梯度，從而在體外實現了更具生理學相關性的細胞行為和血腦屏障功能

微圖案技術（Micropatterning technologies）進一步提升神經模型的可控性：通過限定神經元黏附位置與連接方式，引導神經突沿預設線路生長，實現標準化網絡構建，用于研究神經連接、信號傳遞與細胞間相互作用。

這些技術組合，將體外模型從靜態結構轉變為動態系統，讓細胞與微環境的互作驅動功能發生。

圖4.在μ-Slide VI ^0.4 μ-Pattern ibiTreat lin20, pit170上培養的人類RealDRG。細胞接種前，載玻片在37°C下用絲素蛋白預包被2小時。細胞培養72小時后，進行固定并用MitoTracker和DAPI染色。圖片提供：Moran Amit課題組，MD Anderson Cancer Center，University of Texas

不存在一個單一、完美的體外神經系統模型。每個系統都捕捉了不同層級的復雜性，從孤立的細胞機制到類組織結構和受控的相互作用。

真正的力量在于結合這些方法：

? 以2D體系解析機制

? 以3D培養提升生理相關性

? 以動態微環境逼近體內真實條件

使研究者能夠構建對神經元生物學更全面的理解。

隨著這些技術不斷發展，它們不僅在改進我們研究大腦的方式，也在重新定義神經科學研究的無限可能。

[1] Wu Y-Y, et al. Opportunities and challenges for the use of induced pluripotent stem cells in modelling neurodegenerative disease. Open Biology. 2019;9(1).

[2] Zhu H, et al. Recent advances in 3D models of the nervous system for neural regeneration research and drug development. Acta Biomaterialia. 2025;202:1-26.

[3] Menduti G, Boido M. Recent Advances in High-Content Imaging and Analysis in iPSC-Based Modelling of Neurodegenerative Diseases. Int J Mol Sci. 2023;24(19).

[4] Zehtabian A, et al. Automated Analysis of Neuronal Morphology in 2D Fluorescence Micrographs through an Unsupervised Semantic Segmentation of Neurons. Neuroscience. 2024;551:333-344.

[5] Li Y, et al. Advances and Applications of Brain Organoids. Neurosci Bull. 2023;39(11):1703-1716.

[6] Bose R, Banerjee S, Dunbar GL. Modeling Neurological Disorders in 3D Organoids Using Human-Derived Pluripotent Stem Cells. Front Cell Dev Biol. 2021;9:640212.

[7] Oddo A, et al. Advances in Microfluidic Blood-Brain Barrier Models. Trends Biotechnol. 2019;37(12):1295-1314.