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　　當(dāng)今，建立具有生理學(xué)相關(guān)性的體外組織和器官模型仍然是科學(xué)家的一大挑戰(zhàn)。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要一步，體現(xiàn)在眾多新興技術(shù)將3D培養(yǎng)平臺(tái)與微流控技術(shù)相結(jié)合。事實(shí)上，微流控方法能夠更好地重現(xiàn)生理?xiàng)l件，使細(xì)胞在“類體內(nèi) (in vivo-like)”環(huán)境中生長(zhǎng)[1]。微流控的主要優(yōu)勢(shì)在于持續(xù)供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)清除代謝產(chǎn)物，這種動(dòng)態(tài)過(guò)程有助于減少所需培養(yǎng)基和補(bǔ)充劑的用量 [2]。

　　VITVO® 是一款易于操作的3D細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器。該裝置由一個(gè)內(nèi)部惰性合成基質(zhì)構(gòu)成，并封裝在一個(gè)由兩個(gè)透明氧合膜和一個(gè)帶有進(jìn)樣口和出樣端口的周邊框架組成的結(jié)構(gòu)中。VITVO基質(zhì)允許多種細(xì)胞類型生長(zhǎng)，包括共培養(yǎng)。其裝置結(jié)構(gòu)使得流體能夠穿過(guò)其厚度，從而截留細(xì)胞。得益于VITVO的標(biāo)準(zhǔn)連接件，可以輕松建立一個(gè)實(shí)現(xiàn)3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的流體模型[3]。

　　市面上有多種泵系統(tǒng)。它們的不同特性使其適用于特定的實(shí)驗(yàn)要求。ibidi流體剪切力系統(tǒng)通過(guò)對(duì)充滿培養(yǎng)基的儲(chǔ)液器施加氣壓來(lái)產(chǎn)生流動(dòng)。通過(guò)特殊的切換模式循環(huán)培養(yǎng)基，可以產(chǎn)生恒定的單向流動(dòng)。這使其成為長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)中施加定義剪切應(yīng)力的理想設(shè)置。使用ibidi流體剪切力系統(tǒng)，可以模擬連續(xù)和脈動(dòng)層流，以及振蕩流。

　　本文旨在評(píng)估VITVO生物反應(yīng)器與ibidi流體剪切力系統(tǒng)（ibidi泵系統(tǒng)）之間的兼容性和協(xié)同作用，以開(kāi)發(fā)一種精確定義的微流控應(yīng)用，為3D動(dòng)態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)開(kāi)啟新的可能性（圖1）。

圖1. 整合ibidi流體剪切力系統(tǒng)和VITVO生物反應(yīng)器的示意圖

　　材料

　　• VITVO® 生物反應(yīng)器 (Rigenerand srl)

　　• 2.5 mL注射器 (Becton Dickinson and Co)

　　• 人乳腺癌MDA-MB 231細(xì)胞系(DSMZ, ACC 732)

　　• DMEM/F-12培養(yǎng)基 (Gibco, 31330038)

　　• 人纖維肉瘤HT1080細(xì)胞系(DSMZ, ACC 315)

　　• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM (Gibco, 41965039)

　　• FCS (Gibco, 10270106)

　　• 胰酶/EDTA (Gibco, 15400)

　　• Laminin (BioLamina, LN521-02)

　　• ibidi Pump System流體剪切力系統(tǒng)(ibidi GmbH, 10902)

　　• Perfusion Set Blue灌流管套裝(ibidi GmbH, 10961)

　　• NucBlue™ Live ReadyProbes™™ 試劑 (Hoechst 33342) (Life technologies, R37605)

　　方法

　　3D細(xì)胞培養(yǎng)建立：

　　一個(gè)VITVO基質(zhì)用層粘連蛋白Laminin (60 µg/ml) 包被，并在37°C下孵育過(guò)夜。隨后，MDA-MB 231細(xì)胞以300,000細(xì)胞/mL的濃度重懸于培養(yǎng)基(DM EM/F-12 + 10% FCS)中，并使用注射器注入包被后的VITVO基質(zhì)內(nèi)。同時(shí)，另一個(gè)VITVO接種HT1080細(xì)胞：該基質(zhì)首先用預(yù)熱的培養(yǎng)基（DMEM + 10% FCS）進(jìn)行預(yù)處理，然后將300,000細(xì)胞/mL的HT1080細(xì)胞懸液注入裝置內(nèi)部。兩種3D培養(yǎng)物都在37°C、5% CO²條件下孵育過(guò)夜，以使細(xì)胞貼附到纖維基質(zhì)上，然后再連接到實(shí)驗(yàn)回路。

　　VITVO與ibidi流體剪切力系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)回路設(shè)置：

　　灌流管套裝(Perfusion Set)采用無(wú)菌包裝。為排出硅膠管和塑料部件中的氣體，將灌流管套裝連同包裝一起放入培養(yǎng)箱中過(guò)夜。從包裝中取出灌流管套裝時(shí)，請(qǐng)將流體單元(Fluidic Unit)置于超凈工作臺(tái)內(nèi)。將儲(chǔ)液器插入流體單元的支架中，并檢查適配器的密封性。在連接VITVO裝置前，先進(jìn)行初始的除氣泡、夾管閥測(cè)試和流速校準(zhǔn)。

　　連接VITVO到灌流管套裝時(shí)，用軟管夾夾住管路。取下端口1的封閉帽，將裝置垂直放置，開(kāi)口端口朝上。在開(kāi)口端口處形成彎月面，以避免連接到灌流管套裝的Luer接頭時(shí)截留氣泡。連接端口1后，翻轉(zhuǎn)VITVO，重復(fù)上述步驟連接端口2。移除軟管夾，并在連接好兩個(gè)端口后重新校準(zhǔn)流速。每個(gè)VITVO按照上述描述連接到灌流管套裝，并放置在37°C、5% CO²的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天（圖2A）。

　　結(jié)果與討論

　　MDA-MB 231和HT1080細(xì)胞在ibidi流體剪切力系統(tǒng)動(dòng)態(tài)條件下成功于VITVO培養(yǎng)基中培養(yǎng)，灌流管路中施加的壓力維持在5至10毫巴（圖2A）。培養(yǎng)7天后，細(xì)胞經(jīng)NucBlue Live ReadyProbes染色，并通過(guò)Nikon Eclipse Ti Orca Flash 4.0L顯微鏡搭配4倍物鏡對(duì)3D細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行可視化觀察。明場(chǎng)顯微鏡觀察VITVO基質(zhì)時(shí)僅能顯示基質(zhì)纖維（圖2B左側(cè)）； 細(xì)胞需經(jīng)熒光標(biāo)記或熒光染色方可顯現(xiàn)（圖2B右側(cè)）。NucBlue染色結(jié)果表明兩種細(xì)胞培養(yǎng)物在動(dòng)態(tài)條件下均表現(xiàn)出良好增殖能力，這為根據(jù)實(shí)驗(yàn)的多種需求，設(shè)置ibidi流體剪切力系統(tǒng)和VITVO的定制配置提供了可能性。

　　圖2. A)帶有MDA-MB 231細(xì)胞（左）和HT1080細(xì)胞（右）的VITVO流體回路。B)灌流培養(yǎng)7天后NucBlue染色。寬場(chǎng)熒光顯微鏡，4x物鏡

　　結(jié)論

　　VITVO生物反應(yīng)器和ibidi流體剪切力系統(tǒng)可組合使用，建立適用于不同研究目的的多種3D動(dòng)態(tài)培養(yǎng)體系。VITVO裝置的多功能性支持多種細(xì)胞類型的體外培養(yǎng)，由此衍生出多種應(yīng)用可能性。將ibidi流體剪切力系統(tǒng)與小型VITVO生物反應(yīng)器結(jié)合使用，可開(kāi)發(fā)出多種動(dòng)態(tài)3D細(xì)胞培養(yǎng)模型，以更逼真地模擬體內(nèi)環(huán)境中的間質(zhì)流，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)流速和剪切應(yīng)力的精確調(diào)控。

　　參考文獻(xiàn)

　　[1].Van Duinen V, Trietsch S J, Joore J, Vulto P and Hankemeier T. Microfluidic 3D cell culture: tools to tissue models. Current Opinion in Biotechnology. 2015, 35:118-126.

　　http://dx.doi.org/10.1016/j.copbio.2015.05.002

　　[2].Chen C, Townsend A D, Hayter E A, Birk H M, Sell S A, Scott Martin R. Insert-based microfluidics for 3D cell culture with analytical and bioanalytical chemistry. Analytical and Bioanalytical Chemistry. DOI: 10.1007/s00216-018-0985-y.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0985-y

　　[3]. Candini O, Grisendi G, Foppiani EM, et al. A Novel 3D In Vitro Platform for Pre-Clinical Investigations in Drug Testing, Gene Therapy, and Immuno-oncology. Sci Rep. 2019;9(1):7154. Published 2019 May 9. doi:10.1038/s41598-019-43613-9.