date:2026-03-23 11:45:11
理解細(xì)胞侵襲對(duì)于揭示腫瘤進(jìn)展和免疫細(xì)胞遷移的機(jī)制至關(guān)重要，這兩者都是疾病發(fā)展和治療反應(yīng)的核心。本方案描述了一種趨化性驅(qū)動(dòng)的侵襲實(shí)驗(yàn)，使用3D自插式微孔插件 (micro-Inserts 3D for self-insertion)，插件內(nèi)并填充I型膠原蛋白(collagen I)基質(zhì)，用于評(píng)估Jurkat T細(xì)胞的遷移行為。 代表快速遷移淋巴細(xì)胞的Jurkat細(xì)胞被接種在膠原凝膠的頂部，并通過相鄰儲(chǔ)液池中不同濃度的胎牛血清（FCS）產(chǎn)生的血清梯度進(jìn)行刺激。24小時(shí)后，通過成像和深度量化評(píng)估細(xì)胞向膠原基質(zhì)內(nèi)的侵襲情況。與化學(xué)均質(zhì)環(huán)境中的細(xì)胞相比，暴露于FCS梯度的細(xì)胞顯示出顯著更深的侵襲，這與血清的絕對(duì)存在與否無關(guān)。 該設(shè)置模擬了3D環(huán)境中的趨化性侵襲，突顯了方向性信號(hào)在促進(jìn)細(xì)胞通過細(xì)胞外基質(zhì)組分進(jìn)行主動(dòng)遷移中的作用。該方案提供了一個(gè)強(qiáng)大且可重復(fù)的平臺(tái)，用于在生理相關(guān)條件下研究免疫細(xì)胞遷移和腫瘤微環(huán)境相互作用。 1.1 試劑和緩沖液 3D自插式微孔插件micro-Inserts 3D for self-insertion (80499, ibidi GmbH) μ-Plate 24 Well, ibiTreat (82426, ibidi GmbH) Collagen Type I, Bovine (I型膠原，牛源) (50303, ibidi GmbH) Jurkat細(xì)胞(ACC 282, DSMZ GmbH) RPMI 1640培養(yǎng)基(21875034, Gibco, Thermo Fisher Scientific) 胎牛血清(FCS, 10270106, Gibco, Thermo Fisher Scientific) 10× RPMI 1640培養(yǎng)基 (R1145, Sigma) 超純水配制的NaOH (1 M) NaHCO?7.5% (S8761, Sigma) 無菌超純水 1.2 設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱(加濕，37°C，5% CO?) 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(無菌操作臺(tái)，細(xì)胞消化試劑盒，培養(yǎng)瓶，帶合適吸頭的移液器等) 冷卻的鋁珠或冰塊 每個(gè)實(shí)驗(yàn)需制備三種不同的樣本，每種樣本均設(shè)置三個(gè)重復(fù)： 1.梯度樣品 (-/+)：僅在micro-Insert 3D的外側(cè)孔中添加趨化因子（本例中為10% FCS）。 2.均一分布樣品 (+/+)：整個(gè)樣品（即外側(cè)孔、內(nèi)側(cè)孔和凝膠基質(zhì)中）均含有10% FCS。 3.無趨化因子樣品 (-/-)：培養(yǎng)基和凝膠中均不添加FCS。 圖1：三種實(shí)驗(yàn)條件的示意圖（上：-/+，中：+/+，下：-/-）：細(xì)胞被接種在3D微孔插件內(nèi)的3D膠原基質(zhì)上。上（-/+）：在微孔插體的外側(cè)孔中加入趨化因子溶液，并讓細(xì)胞侵入基質(zhì)1-3天（具體時(shí)間取決于細(xì)胞類型）。中（+/+）：在微孔插體的內(nèi)側(cè)和外側(cè)孔中均加入趨化因子溶液（形成均一濃度環(huán)境）。下（-/-）：未加入任何趨化因子。 2.1 樣本制備 將九個(gè)micro-Inserts 3D分別放入µ-Plate 24 well 24孔培養(yǎng)板的孔中。輕輕按壓每個(gè)插件以去除截留的氣泡，并確保其與表面牢固接觸。 向培養(yǎng)板的空余孔中填充無菌水或PBS，以減少孵育期間的蒸發(fā)。 2.2 膠原凝膠制備 在開始制備凝膠前，請(qǐng)閱讀I型膠原蛋白（Collagen Type I）說明書。 本實(shí)驗(yàn)需要制備兩種膠原凝膠混合物： 不含血清(用于-/+和-/-樣品) 含10%胎牛血清(FCS)(用于+/+樣品) 重要提示：膠原凝膠的移液操作 進(jìn)行膠原凝膠移液時(shí)，請(qǐng)務(wù)必使用預(yù)冷的移液器吸頭(4°C)。 對(duì)于I型膠原凝膠的制備，由于凝膠粘度高，建議所有步驟均采用反向移液法。將移液器按壓至第二壓力點(diǎn)，使整個(gè)吸頭充滿凝膠。排液時(shí)僅需按壓至第一壓力點(diǎn)，雖然此時(shí)槍頭內(nèi)會(huì)殘留少量膠原液（需棄去），但這種方法能確保排出的膠原體積更加精確。我們推薦使用Eppendorf Visco Tips或Gilson Microman E等產(chǎn)品。 請(qǐng)注意，即使在4°C下，凝膠混合物也最多只能在5分鐘內(nèi)使用，之后便會(huì)開始部分凝膠。 1.按照表1的配比，制備膠原混合液（1.5 mg/ml牛源膠原，含或不含10%血清）。請(qǐng)按表1所列順序添加各組分，并用移液器充分混勻，操作時(shí)置于冰上以延緩凝膠化。 2.向每個(gè)micro-Insert 3D的內(nèi)側(cè)孔中加入20 μl混合液。為確保形成平整的膠原層，將移液器垂直對(duì)準(zhǔn)孔中央進(jìn)行加樣。 3.蓋上培養(yǎng)板蓋子，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中聚合約30分鐘。 注意：如需便捷地計(jì)算不同膠原濃度，可直接使用ibidi官網(wǎng)提供的ibidi膠原濃度計(jì)算器(ibidi Collagen Calculator)。 表1：配制300 μl含或不含F(xiàn)CS的1.5 mg/ml I型膠原基質(zhì)的移液方案 2.3 細(xì)胞接種 1.在凝膠聚合期間，按常規(guī)方法收集細(xì)胞。 2.制備兩份細(xì)胞懸液，濃度為3 × 10?細(xì)胞/ml： 細(xì)胞懸液1：使用無血清培養(yǎng)基（用于 -/- 和 -/+ 樣品） 細(xì)胞懸液2：使用含10% FCS的培養(yǎng)基（用于 +/+ 樣品） 3.從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，在顯微鏡下確認(rèn)凝膠聚合情況。如果基質(zhì)未完全聚合，可再孵育10-15分鐘。 4.按以下方式向每個(gè)micro-Insert 3D的外側(cè)孔中填充250 μl培養(yǎng)基： 對(duì)于 -/- 樣品：使用無血清培養(yǎng)基 對(duì)于 -/+ 和 +/+ 樣品：使用含10% FCS的培養(yǎng)基 5.向每個(gè)孔的凝膠基質(zhì)上方加入25 μl相應(yīng)的細(xì)胞懸液。注意避免移液器吸頭觸碰凝膠基質(zhì)。 6.蓋上培養(yǎng)板蓋子，將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱。讓細(xì)胞侵入凝膠24小時(shí)。 3. 成像 1.24小時(shí)后，使用相差顯微鏡記錄細(xì)胞在凝膠基質(zhì)中的侵襲情況。 2.對(duì)于每個(gè)micro-Insert 3D插件中部選擇三個(gè)隨機(jī)的XY位置（膠原層平整處）。在每個(gè)位置采集一個(gè)z-stack，從凝膠頂部（細(xì)胞聚焦處）開始，一直掃描到孔的底部，Z軸步長(zhǎng)為13 µm。 注意: 相鄰圖像之間的z間隔應(yīng)大致等于單個(gè)細(xì)胞的直徑（約8–15 µm），以確保最終圖像堆棧中能捕獲所有細(xì)胞。 圖 2：在FCS梯度(-/+)條件下，Jurkat細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)入凝膠基質(zhì)24小時(shí)的Z軸堆疊掃描（z-stack）代表性圖像。在micro-Insert 3D內(nèi)的同一位置，于不同Z平面上采集的相差顯微鏡圖像。第一張圖像（0 µm）顯示細(xì)胞位于凝膠基質(zhì)頂部。在隨后的圖像中，只有浸潤(rùn)到指定深度的細(xì)胞處于聚焦?fàn)顟B(tài)。圖像使用Zeiss Axio Observer Z1顯微鏡配備40× LD Plan-Neofluar物鏡拍攝。 為評(píng)估細(xì)胞對(duì)趨化因子FCS的侵襲響應(yīng)，需為每個(gè)孔計(jì)算一個(gè)深度分?jǐn)?shù)，該分?jǐn)?shù)基于各z平面圖像中處于焦平面的細(xì)胞數(shù)量，反映細(xì)胞向基質(zhì)內(nèi)的侵襲深度。 侵襲指數(shù)的計(jì)算方法為：將每個(gè)深度h處（nh）的（處于焦平面的）細(xì)胞總數(shù)乘以對(duì)應(yīng)的深度h（單位為µm），并除以所有深度內(nèi)細(xì)胞的總數(shù)（N）： 圖3：Jurkat細(xì)胞在FCS梯度下的趨化驅(qū)動(dòng)侵襲。柱狀圖顯示平均侵襲指數(shù)。數(shù)據(jù)表示24小時(shí)后的平均值+SEM（標(biāo)準(zhǔn)誤）(n = 2個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次)。結(jié)果顯示，與處于FCS濃度均一環(huán)境下的樣本相比，暴露于FCS梯度的細(xì)胞向膠原基質(zhì)內(nèi)的侵襲深度顯著更深。注：在本示例中，對(duì)于橫跨多個(gè)層面（slices）的細(xì)胞，僅在細(xì)胞中心平面聚焦的層面進(jìn)行一次計(jì)數(shù)。 5. 總結(jié) 這種使用micro-Insert 3D進(jìn)行的趨化性驅(qū)動(dòng)侵襲實(shí)驗(yàn)，為定量分析3D膠原基質(zhì)中的免疫細(xì)胞遷移提供了一種可靠且具有生理相關(guān)性的方法。在不同血清條件下觀察到的浸潤(rùn)深度差異，突顯了方向性信號(hào)（directional cues）在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中的重要性。該方案非常適用于趨化行為的對(duì)比研究，并可針對(duì)其他細(xì)胞類型或趨化因子進(jìn)行調(diào)整，從而探索細(xì)胞侵襲及微環(huán)境相互作用的多個(gè)維度。
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